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本试剂盒提供了一种简便的地从培养细胞或贴壁细胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括细胞器膜如线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜上的膜蛋白。

本试剂盒与许多用于分离膜蛋白的程序不同，该试剂盒不需要超声，不需要耗时的超速离心，不使用去垢剂，最大限度地保持了膜蛋白在细胞内的原始状态。提取的基本原理是通过提取溶液和离心柱的协调作用提取得到高纯度的膜蛋白。膜蛋白提取溶液可以温和作用于细胞膜，改变细胞的渗透压，然后在高速离心下细胞通过离心柱，这个过程中细胞膜会破裂；收集液700g低速离心分离去除细胞核，因此消除了膜组分中细胞核组份的污染；随后上清使用常规台式低温离心机（无需超速离心）16000g高速离心，沉淀即为膜蛋白。

本试剂盒约60分钟即可完成培养细胞膜蛋白的提取。膜蛋白是在温和、非变性条件下提取的，结合不同的溶解液，溶解后的膜蛋白可以用于SDS-PAGE变性电泳检测、Blue Native非变性电泳检测以及等电聚焦电泳等。另外，膜蛋白也可以用于酶活性测定，免疫沉淀，ELISA测定等。

• 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。
  
• 将膜蛋白提取溶液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2mL连盖收集管中，盖好管盖，放置于冰上预冷。
  
• 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制剂母液是100×，添加时按照1:100添加，即1mL膜蛋白提取溶液添加10μL抑制剂）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。
  
• 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度试剂盒(货号：RFT057)。

• 准备溶液：
  混匀膜蛋白提取溶液，立即放置在冰上。取适当量的溶液，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），随后立即放于冰上待用。按照下表大体估算膜蛋白提取溶液使用体积：
  

  细胞类型	培养器皿	细胞数量	细胞沉淀体积(PCV)(μL)	膜蛋白提取溶液(μL)
  悬浮细胞		2～5×106	20～50	200
  		5～10×106	＞50	500
  贴壁细胞	96孔板	~1×105	调整细胞数目到2～5×106	200
  	24孔板	~5×105	调整细胞数目到2～5×106	200
  	6孔板	~2.5×106	~25	200
  	25cm2培养瓶	~2×106	~20	200
  	75cm2培养瓶	~8×106	~80	500
  	35mm培养皿	~2×106	~20	200
  	60mm培养皿	~5×106	~50	500
  	100mm培养皿	~1.5×107	调整细胞数目到2～5×106	200

  • (二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCM，Packed Cell Volume）大约为20μL。
• 准备细胞：
  
  • 贴壁细胞：细胞用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。400g（~2000rpm） 4℃离心5min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。
    
  • 悬浮细胞：400g（~2000rpm）4℃离心5min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
• 裂解细胞膜：
  
  • 细胞沉淀中加入准备好的膜蛋白提取溶液（含蛋白酶抑制剂），用移液器吹打重悬细胞沉淀，涡旋剧烈震荡30～60秒，冰浴处理10分钟，间歇2-3混匀。
    
    • 提取溶液使用推荐经验值：起始细胞数低于5×10⁶加入200μL提取溶液，起始细胞数量5×10⁶～1×10⁷加入500μL提取溶液。如果细胞数目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建议调整细胞数目在2～5×10⁶范围内。
  • 将细胞悬液转移到离心柱中，盖上管盖，16000g(~13000rpm) 4℃离心1分钟，离心后收集管底部会有沉淀形成。
    
    • 离心柱最大体积为600μL；确保离心机可以在10秒内达到16000g。
  • 弃去离心柱，盖好2mL收集管管盖，用1mL移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。
• 去除细胞核：
  溶液700g(~2700rpm) 4℃离心1分钟，用200μL吸头小心将上清（上清稍有浑浊）转移到新的1.5mL离心管中。
  
  • 转速不要超过700g，否则会降低膜蛋白的得率。
  • 关键步骤：吸取上清时不要触及沉淀，甚至可以丢弃部分上清不吸取，以免上清（含膜蛋白）中污染核蛋白。如果使用200μL提取溶液，建议吸取150μL上清；使用500μL提取溶液，建议吸取400μL上清。此步骤得到的细胞核纯度不高，混杂有没有完全破碎的完整细胞，不建议用于相关实验。
• 沉淀膜蛋白：
  上清溶液16000g(~13000rpm) 4℃离心30分钟，用200μL吸头吸弃上清，沉淀即为提取的膜蛋白。上清是胞浆蛋白，如需要可保存备用。
  
  • 关键步骤：此步骤必须完全将上清吸取干净，可以分次吸取上清，最后用10μL吸头将残余上清彻底吸净，以免膜蛋白中污染胞浆蛋白。

• 不建议加入超过50μL溶解液，会导致蛋白浓度偏低。

• 膜蛋白变性样品处理：
  
  • 建议使用50μL变性蛋白溶解液溶解膜蛋白；
    
  • BCA方法测定蛋白浓度；
    
  • 用变性蛋白溶解液调整蛋白浓度为1μg/μl，按需分装，每管50μL，-80℃保存待用；
    
  • 取一管50μL样品加入SDS-PAGE上样缓冲液（货号：RFT071、RFT241、RFT477）处理，建议调整上样液浓度为0.5μg/μL；对于多次跨膜蛋白的变性电泳检测，样品建议使用37℃处理30分钟或者70℃处理10分钟，不要95℃加热5分钟，因为在95℃高温情况下，多次跨膜蛋白极易聚集形成多聚体，样品会聚集，WB检测会表现为比实际蛋白大小更大的分子量；
    
  • 使用SDS-PAGE凝胶（货号：RTD6132，RTD6116）电泳，每个泳道上样10～40μL（5～20μg）。
• 膜蛋白BN非变性样品处理：
  
  • 建议使用50μL膜蛋白重悬液(BN电泳用，货号：RFT475)重悬膜蛋白沉淀；
    
  • BCA方法测定蛋白浓度(货号：RFT057)；
    
  • 用膜蛋白重悬液（BN电泳用）调整蛋白浓度为1μg/μL，按需分装，每管50μL，-80℃保存待用；
    
  • 取一管50μL样品，溶化混匀后4℃ 16000g 5分钟，去除上清，保留沉淀；
    
  • 沉淀中加入50μL膜蛋白增溶液A，轻柔重悬沉淀，尽量不产生气泡，冰浴10分钟；
    
    • 膜蛋白增溶液A配制方法：在增溶剂粉末管中加入2.5mL溶解缓冲液，加入超纯水精准定容至5mL，彻底混匀，增溶液中DDM终浓度为1%。
  • 4℃ 16000g 15分钟，取上清至一干净1.5mL离心管中即为增溶后膜蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此时得到的膜蛋白浓度为1μg/μL，其中去垢剂DDM终浓度为1%；
    
  • 膜蛋白溶液中加入1/10体积10×膜蛋白A型上样缓冲液（配套膜蛋白增溶液A使用，货号：RFT472），使用BN凝胶电泳（货号：RFT462、RFT463、RFT470），每个泳道上样5～20μg。
• 膜蛋白等电聚焦样品处理（2D凝胶第一维电泳）：
  建议膜蛋白沉淀中使用溶解液：7M尿素，2M硫脲，2% CHAPS，20mM DTT(自备，试剂盒不提供)。

• 膜蛋白产量
  

  细胞系	细胞数量	膜蛋白
  K562	1×107	50～80μg
  Jurkat	1×107	80～100μg
  Hela	1×107	100～150μg
  NIH-3T3	1×107	80～120μg

• 膜蛋白质量评价
  膜蛋白质量评价首先看提取的蛋白是否是膜蛋白，其次要看膜蛋白是否有明显的富集，其三要看提出的膜蛋白是否有其他组分交叉污染，最后看提取的膜蛋白中是否可以检测出目的蛋白。使用专门的膜内参检测（下表），可以初步确认提出的是膜蛋白。膜蛋白是否有效富集需要用总蛋白作为对照，与总蛋白相比，膜蛋白中膜蛋白内参是否有明显富集。膜蛋白中的交叉污染可以用其他组分内参检测膜蛋白样品，如关注膜蛋白中是否有细胞核蛋白污染，可以使用核蛋白内参如Lamin B1检测膜蛋白，检测无条带即说明膜蛋白与细胞核组分无交叉污染。用目标蛋白抗体检测膜蛋白，验证是否可以检测到目的蛋白，蛋白大小是否符合预期。
  

  位置	内参名称	大小kD
  细胞膜	Na-K ATPase	100
  内质网膜	Calnexin	~90
  线粒体膜	COX IV	17

  许多研究人员利用WB对分离的膜蛋白进行纯度检测，经常发现一些常用的胞浆内参能在膜蛋白中检测到，例如β-actin,GAPDH和β-tubulin，这是由于这些胞浆内参不仅存在于胞浆也存在于质膜中，因此可以在膜蛋白中检测到胞浆内参。